細(xì)胞核定位信號(hào)（NLS）能夠促進(jìn)蛋白定位于細(xì)胞核中，科研人員通過(guò)基因工程技術(shù)，將NLS基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合，插入植物雙元表達(dá)載體pRI101中，獲得一個(gè)新的pRI101-NLS-GFP植物表達(dá)載體，該載體有望在病原菌蛋白細(xì)胞生物學(xué)功能研究中得到廣泛應(yīng)用。請(qǐng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下列問(wèn)題：

（1）若已知NLS基因的脫氧核苷酸序列，則可采用

人工合成

人工合成

法獲得該目的基因。該方法在獲取目的基因時(shí)

不需要

不需要

（填“需要”或“不需要”）模板。
（2）在構(gòu)建NLS-GFP融合基因時(shí)，需在設(shè)計(jì)引物

5’端

5’端

時(shí)添加同源序列。將添加同源序列的GFP與NLS融合，用特定的DNA酶處理，形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)

黏性末端堿基配對(duì)

黏性末端堿基配對(duì)

形成NLS-GFP融合基因。
（3）為獲得融合熒光蛋白，設(shè)計(jì)P₄時(shí)不能包含終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致

綠色熒光蛋白（GFP）不含有NLS定位信號(hào)

綠色熒光蛋白（GFP）不含有NLS定位信號(hào)

。
（4）過(guò)程④在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選擇

NdeⅠ、SmaⅠ

NdeⅠ、SmaⅠ

酶連接。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)需要用氯化鈣處理，其目的

使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

。
（5）在受體細(xì)胞中，NLS被相應(yīng)蛋白質(zhì)識(shí)別后通過(guò)

核孔

核孔

進(jìn)入

細(xì)胞核

細(xì)胞核

，所以可觀察到綠色熒光主要漿集在此處。為了更具科學(xué)性，應(yīng)向?qū)φ战M的受體細(xì)胞中導(dǎo)入

不含融合基因雙元表達(dá)載體pRⅠ101

不含融合基因雙元表達(dá)載體pRⅠ101

質(zhì)粒。