啟動(dòng)子可分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。³⁵S啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，能夠持續(xù)、高效地啟動(dòng)目的基因在植物各種組織中的表達(dá)，但往往也會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育；Rd29A啟動(dòng)子是一種逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。沙冬青脫水素基因（AmDHN基因）能使植株具有較強(qiáng)的抗旱作用?？蒲腥藛T構(gòu)建Rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AmDHN基因表達(dá)的載體，過程如圖1。再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化“敖漢苜?！蹦秃敌缕贩N，以期在干旱地區(qū)發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)。

限制酶	BclⅠ	SacⅠ	BamHⅠ	PstⅠ	SmaⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)	T↓GATCA	GAGCT↓C	G↓GATCC	CTGCA↓G	CCC↓GGG

回答下列問題：
?
（1）科研人員擴(kuò)增Rd29A啟動(dòng)子所設(shè)計(jì)的引物如下，根據(jù)引物的堿基序列及限制酶的識(shí)別序列分析，構(gòu)建載體2時(shí)選用的限制酶是

SmaI和SacI

SmaI和SacI

。為了提高構(gòu)建載體3的成功率，選用

BclI和SacI

BclI和SacI

酶切割載體1、2。
上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3'
下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3'
（2）載體5需先轉(zhuǎn)入

農(nóng)桿菌

農(nóng)桿菌

后再轉(zhuǎn)化苜蓿，轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加

新霉素

新霉素

，以篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。
（3）為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因苜蓿中AmDHN基因的轉(zhuǎn)錄水平，挑選10株轉(zhuǎn)基因植株，利用自來水和20%PEG（模擬干旱條件）處理8h,提取RNA通過RT-PCR檢測(cè)AmDHN基因和MtActin基因（一種骨架蛋白基因）的表達(dá)水平，其結(jié)果如圖2：
①選擇MtActin基因轉(zhuǎn)錄水平作為參照的依據(jù)是MtActin基因在各細(xì)胞中表達(dá)

相對(duì)恒定

相對(duì)恒定

。
12345123AmDHN②自來水處理和20%PEG條件下的AmDHN基因表達(dá)水平的差異說明：

干旱能誘導(dǎo)Rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄

干旱能誘導(dǎo)Rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄

。