重組人纖溶酶原激活劑（hPA）能夠高效特異性地溶解血栓，目前已培育成功rhPA轉(zhuǎn)基因兔，作為乳腺生物反應(yīng)器批量生產(chǎn)藥物。某科研團(tuán)隊構(gòu)建的PCL25/hPA重組質(zhì)粒如圖1所示（該質(zhì)粒以β-casein作為調(diào)控序列，以CMV為啟動子，圖1中SadⅠ、XhoⅠ、NotⅠ所在位置表示相關(guān)限制酶切點），圖2為培育rhPA轉(zhuǎn)基因兔時用的乳腺特異性表達(dá)載體及PCR檢測原理圖（PCR-F、PCR-R為引物序列）。請回答下列問題：
（1）據(jù)圖1推測，PCL25/rhPA重組質(zhì)粒是在PCL25質(zhì)粒的
XhoⅠ
XhoⅠ
限制酶切位點處插入化學(xué)合成的rhPAcDNA片段構(gòu)建而成。rhPA基因上游的CMV能被 RNA聚合酶
RNA聚合酶
識別并結(jié)合，從而開啟轉(zhuǎn)錄過程。
（2）為獲得圖2的乳腺特異性表達(dá)載體需用 SalⅠ和NotⅠ
SalⅠ和NotⅠ
切割PCL25/rhPA重組質(zhì)粒使之線性化。PCR-F和PCR-R設(shè)計時依據(jù)的是 CMV和rhPA基因的部分脫氧核苷酸序列
CMV和rhPA基因的部分脫氧核苷酸序列
序列。
（3）對實驗得到的1～6號仔兔進(jìn)行PCR及產(chǎn)物檢測，得到圖3所示結(jié)果，則成功導(dǎo)入rhPA基因的仔兔有 2、3、5、6
2、3、5、6
。（注：M道條帶可作為雙鏈線狀DNA分子量大小的參照，7道為顯微注射片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作陽性對照）
（4）生長激素（GH）可促進(jìn)動物細(xì)胞增殖和乳腺生長發(fā)育及維持泌乳。研究人員將GH基因?qū)雛hPA單轉(zhuǎn)基因兔體內(nèi)，獲得rhPA/GH雙轉(zhuǎn)基因兔，以期提高兔乳清中的rhPA表達(dá)量。
①完成下列表格：
| 實驗?zāi)康?/td>
| 簡要操作過程 |
| 顯微注射用基因片段的準(zhǔn)備 |
將PCL25/GH質(zhì)粒雙酶切而線性化，電冰分離不同大小分子量的基因片段，回收真核基因片段待用 |
| 對兔進(jìn)行 超數(shù)排卵 超數(shù)排卵 和同期發(fā)情處理 |
選取3只未發(fā)情的rhPA單轉(zhuǎn)基因兔作為供體（標(biāo)號a、b、c），適量注射FSH/hCG（兩種促性腺激素），與正常公兔配種，在母兔的 輸卵管 輸卵管 （填部位）形成受精卵。在供體兔配種的同時，選取成年健康新西蘭母兔作為受體，耳緣靜脈注射適量hCG。 |
| 雙轉(zhuǎn)基因兔的制備 |
將顯微注射基因片段導(dǎo)入受精卵的原核內(nèi)，適宜條件培養(yǎng)，胚胎移植。 |
| 轉(zhuǎn)基因兔的整合篩選 |
無菌剪取新生仔兔的耳尖組織少許，提取基因組。針對rhPA和GH兩種基因，設(shè)計 2 2 對引物進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定條帶大小是否正確。 |
| rhPA含量測定 |
分別測定 rhPA單轉(zhuǎn)基因兔和rhPA/GH雙轉(zhuǎn)基因兔 rhPA單轉(zhuǎn)基因兔和rhPA/GH雙轉(zhuǎn)基因兔 乳清中的rhPA的表達(dá)量。 |
②分析實驗結(jié)果
| 樣本 |
供體兔a |
供體兔b |
供體兔c |
| rhPA表達(dá)水平（μg?mL-1） |
42.2 |
42.8 |
15.2 |
| 樣本 |
雙轉(zhuǎn)基因兔a1 |
雙轉(zhuǎn)基因兔a2 |
雙轉(zhuǎn)基因兔b1 |
雙轉(zhuǎn)基因兔c1 |
| rhPA表達(dá)水平（μg?mL-1） |
432 |
444 |
636 |
248 |
（注：雙轉(zhuǎn)基因兔a1、2親本來源為供體兔a,雙轉(zhuǎn)基因兔b1親本來源為供體兔b,雙轉(zhuǎn)基因兔c1親本來源為供體兔c）
實驗結(jié)果表明，
rhPA/GH雙轉(zhuǎn)基因兔乳腺表達(dá)rhPA水平明顯高于rhPA單轉(zhuǎn)基因兔，GH可協(xié)同促進(jìn)rhPA在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中的高效表達(dá)
rhPA/GH雙轉(zhuǎn)基因兔乳腺表達(dá)rhPA水平明顯高于rhPA單轉(zhuǎn)基因兔，GH可協(xié)同促進(jìn)rhPA在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中的高效表達(dá)
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