采用IRES序列連接AFP基因（甲胎蛋白基因）和IL-2基因（白細胞介素-2基因）構建雙基因共表達重組載體，能夠利用同一載體同時表達出人甲胎蛋白以及人白細胞介素-2。該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發(fā)揮細胞因子的免疫調節(jié)作用，又能靶向性地針對肝癌產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應。如圖為雙基因共表達重組載體的結構示意圖。回答下列問題：
（1）從肝癌HepG2細胞中獲取mRNA并逆轉錄成cDNA作為模板，用含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的AFP基因片段。
①AFP基因PCR反應體系中需要加入模板、酶、引物和維持pH穩(wěn)定的 緩沖液緩沖液，還需加入 Mg2+Mg2+以激活耐高溫DNA聚合酶的活性。
②將限制酶BglⅡ、EcoRⅠ的識別序列接在AFP引物的5'端，原因是 使引物的3'端與模板鏈嚴格互補配對，且不影響子鏈的延伸使引物的3'端與模板鏈嚴格互補配對，且不影響子鏈的延伸，上游引物與下游引物四種堿基的堿基比相當，若上游引物核苷酸數(shù)目較多時，這一差異會直接影響PCR中的 復性復性步驟。
（2）用限制酶BglⅡ、EcoRⅠ分別酶切PIRES2-EGFP質粒得到AFP基因片段，并使用T4DNA連接酶進行連接，得到PIRES2-AFP-EGFP重組載體；從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstXⅠ和NotⅠ酶切黏性末端的IL-2特異性引物進行PCR擴增，得到的IL-2基因與酶切后PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，得到PIRES2-AFP-IL-2重組載體。上述表達載體的構建過程中，獲取目的基因及切割質粒均使用兩種限制酶的目的是 防止目的基因及質粒自身環(huán)化；保證目的基因和載體之間的定向、準確連接（防止目的基因與載體反向連接）防止目的基因及質粒自身環(huán)化；保證目的基因和載體之間的定向、準確連接（防止目的基因與載體反向連接）。
（3）IRES是mRNA5'端具有的一段較短的RNA序列，這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結構，從而介導核糖體與RNA結合，開啟蛋白質翻譯過程。與兩個基因直接連接形成融合基因相比，兩個基因之間插入IRES序列的意義是 利用一種mRNA可連續(xù)翻譯出兩種蛋白質利用一種mRNA可連續(xù)翻譯出兩種蛋白質。
（4）人的AFP基因和IL-2基因能在奶牛膀胱上皮細胞中表達的原因是 生物界共用一套遺傳密碼生物界共用一套遺傳密碼。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】緩沖液；Mg2+；使引物的3'端與模板鏈嚴格互補配對，且不影響子鏈的延伸；復性；防止目的基因及質粒自身環(huán)化；保證目的基因和載體之間的定向、準確連接（防止目的基因與載體反向連接）；利用一種mRNA可連續(xù)翻譯出兩種蛋白質；生物界共用一套遺傳密碼
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/7/31 8:0:9組卷：6引用：2難度：0.6
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1．下列有關基因工程技術和蛋白質工程技術敘述正確的是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：6引用：1難度：0.7 -
2．下列有關基因工程的敘述，正確的是（ ）
發(fā)布：2024/12/31 5:0:5組卷：3引用：2難度：0.7 -
3．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化幾丁質水解。通過基因工程將幾丁質酶基因轉入植物體內，可增強其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉栴}：
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀?和。
（2）生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的。
（3）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有和，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是。當幾丁質酶基因和質粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是。
（4）提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（5）若獲得的轉基因植株（幾丁質酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中）抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：2引用：2難度：0.6